В статье приведены методологические разработки по выделению и опознанию перспективного онкомаркера – свободно циркулирующей дезоксирибонуклеиновой кислоты (сцДНК). Это первый систематический обзор методологических факторов, влияющих на восстановление и количественную оценку сцДНК, что позволяет сделать рекомендации по стандартизации методологических подходов к разработке сывороточных тестов на рак.

Авторы провели большую работу по систематизации имеющихся доказательных данных как в части технических вопросов выделения свободно циркулирующей ДНК, так и в вопросе выбора биоматериала для проведения биопсии. Рассмотрены подбор пробирки, подготовка крови, время её обработки, выделение и фиксация ДНК, температура и скорость центрифугирования. В таблице 8  приводятся методологические рекомендации по стандартизации данного метода.

Было проанализировано 4172 статьи по медицинским базам данных. По критериям отбора авторы выделили около 310. Подробно изучив все имеющиеся материалы, свели все данные в таблицу методологических указаний для стандартизации исследования свободно циркулирующей ДНК.

Свободно циркулирующая ДНК исследуется методом жидкостной биопсии при раке в целях изучения его раннего выявления, мониторинга прогрессирования и терапевтического ответа. Этот систематический обзор первичной литературы по сцДНК направлен на выявление и оценку факторов, влияющих на восстановление сцДНК, и наметить основанные на доказательной базе рекомендации для стандартизации методов.
 
Таблица 8. Доказательно обоснованные методологические рекомендации для обработки и анализа сцДНК.
*недостаточно данных для комментирования метода (например, цифровая ПЦР)
Исследуемый фактор Рекомендации Обоснование
Тип образца крови Плазма для аналитических методов, чувствительных к фону дикого типа ДНК; плазма или сыворотка крови для всех других методов Уровень сцДНК в сыворотке возрастает значительнее чем в плазме из-за присоединения геномной ДНК
Условия хранения крови и время обработки Кровь с ЭДТА может храниться при комнатном температурном режиме или 4° C и должна быть обработана в течение 6
ч. При использовании специализированных пробирок следует придерживаться
рекомендаций производителя		 Хранение образца крови при комнатной температуре
не влияет на уровень сцДНК. Уровень сцДНК увеличивается
в крови с ЭДТА, обработанной позднее чем через 6 часов.
Скорость и время центрифугирования образца крови Центрифугирование крови, а затем повторное центрифугирование плазмы до
хранения для изоляции сцДНК (двойное вращение).
Скорость и температура центрифугирования (комнатная
температура или 4⁰ C) не являются критическими.		 Плазма может быть заражена клетками из охристого
слоя. Второе вращение помогает
минимизировать вероятность загрязнения
плазмы клетками из охристого слоя.
Метод изоляции и квантификации ДНК Следуйте рекомендациям производителя для сцДНК. Квантификация посредством количественной ПЦР или флуометрии. Квантификация сцДНК показывает чудесное согласование количественной ПЦР, цифровой ПЦР и флуометрии.

Источник:  

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6074610/pdf/main.pdf

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30094369

R. M. Trigg, L. J. Martinson, S. Parpart-Li, J. A. Shaw. Р. М. Тригг, Ю. Л. Мартинсон, С. Парпарт-Ли,      Ю. А. Шо. Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature.
Статья опубликована в «Heliyon», выпуск 7, часть 4, статья № e00699, 25 июля 2018, стр.1-24. Аrticle published in Helicon, issue 7, part 4, article no. e00699, 25 July 2018, pp. 1 - 24.